熊去氧胆酸（Ursodeoxycholic Acid）的异构体难题：从原料药杂质到生物等效性分析

一、熊去氧胆酸是什么？异构体杂质从哪里来？

熊去氧胆酸（UDCA）是一种天然胆汁酸，在熊等冬眠动物的胆汁中含量较高，在人体胆汁酸池中只占少量。它比胆酸、鹅去氧胆酸（CDCA）更亲水，可替代胆汁中疏水性更强、毒性更大的胆汁酸，从而减轻胆汁淤积损伤；临床用于溶解胆固醇性胆结石，以及治疗原发性胆汁性胆管炎（PBC）等胆汁淤积性肝病[1]。

熊去氧胆酸  CAS No.:128-13-2

从结构上看，UDCA 化学名为 3α,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酸（C24H40O4，CAS 128-13-2）[2,3]，其 7α 差向异构体即 CDCA。无论化学法（以牛胆汁来源的胆酸为起始原料，先脱除 12-OH 得到 CDCA）还是酶法（7α-HSDH/7β-HSDH 双酶转化），都要先把 7α-OH 氧化为 7-酮石胆酸（7-KLCA），再还原为 7β-OH[4]。因此，7-KLCA 残留和 CDCA 残留是最直接的工艺杂质。

二、药典控制哪些杂质？

Ph. Eur. 专论 1275 列出杂质 A~I，其中 A（CDCA）和 C（石胆酸）为特定杂质[2]：

名称与结构来源：Ph. Eur. 7.0, 1275[2]；“可能来源”列为依据合成路线的推断。

Ph. Eur. 规定杂质 A ≤1.0%，其他单个杂质 ≤0.10%，总杂质 ≤1.5%；石胆酸另以 TLC 控制，≤0.1%[2]。USP 对鹅去氧胆酸放宽至 ≤1.5%，对石胆酸收紧至 ≤0.05%[3]。

三、没有发色团，异构体怎么分开测？

胆汁酸为饱和甾体骨架，紫外吸收很弱。Ph. Eur. 有关物质采用反相 HPLC + 示差折光检测，进样量达 150 µL；系统适用性要求杂质 H 与 UDCA 分离度 ≥1.5。H 的相对保留时间约 0.9，紧贴主峰；CDCA 约 2.8，与主峰距离较远[2]。USP 有关物质则采用硅胶 TLC、磷钼酸显色[3]。

示差折光无法梯度洗脱，TLC 定量精度有限。已有研究建立 HPLC-CAD（电雾式检测）方法，同时定量 UDCA 中 9 个有关物质，并以 HPLC-Q-TOF-MS 鉴定了 2 个未知杂质[5]。无论换用哪种检测器，峰定位、分离度确认和校正因子测定都需要单个杂质对照品。

四、BE 研究中，异构体问题为什么更突出？

UDCA 是内源性胆汁酸，由肠道菌群 7-HSDH 将 CDCA 的 7α-OH 异构为 7β-OH 生成，体内主要以甘氨熊去氧胆酸（GUDCA）和牛磺熊去氧胆酸（TUDCA）形式存在，成人以 GUDCA 为主[6]。因此 EMA、FDA 和 CDE 均要求基线校正，FDA 与 CDE 还要求同时测定非结合 UDCA 和总 UDCA（含甘氨酸、牛磺酸结合物）[8–10]。

分析上的难点在于：CDCA、异熊去氧胆酸、猪去氧胆酸与 UDCA 的定量离子对相同，方法须对这些物质有区分力，并在验证中考察特异性[7]；游离胆汁酸除含 12-羟基者外缺少可用于 MRM 的特征碎片离子，专属性高度依赖色谱分离[6]。已发表的人血浆方法采用负离子 ESI，以 UDCA-d4、GUDCA-d4、TUDCA-d4 为内标定量[11]。

五、CATO 熊去氧胆酸相关杂质对照品

CATO 提供熊去氧胆酸系列对照品百余个，以下为与上述问题直接相关的代表性品种：

注：EP 杂质 D、E、G、I 及熊去氧胆酸本品（鹅去氧胆酸EP杂质A，C4X-1422）亦有供应；完整清单请联系 CATO 获取。点击货号可查看 CATO 官网产品详情（规格、纯度等）；数据来源：CATO 佳途科技（www.cato-chem.com）。

CATO（广州佳途科技股份有限公司）获 CNAS（RM0030）与 ANAB（AR-2832）双重 ISO 17034 认可，产品随附分析证书（COA）。

常见问题

Q1：BE 方法验证中，如何证明能区分 UDCA 与其异构体？
需在特异性考察中纳入与 UDCA 共用定量离子对的异构体，确认色谱分离，并采用不同来源的空白基质考察干扰，色谱方法还可结合峰纯度评价[7]。异熊去氧胆酸（EP 杂质 H）、牛磺鹅去氧胆酸等异构体对照品可向 CATO 获取。

Q2：氘代内标选 d4 还是 d5？
关键在于质量差能否避开分析物同位素峰的干扰、标记位置是否稳定，并需在验证中考察内标对分析物通道的贡献。CATO 同时提供 UDCA-d4/d5 及 GUDCA、TUDCA 氘代物，可按方法需要选择。

参考文献

[1] LiverTox: Clinical and Research Information on Drug-Induced Liver Injury. Ursodiol (Ursodeoxycholic Acid). Bethesda (MD): National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases; updated 2017-09-25. NCBI Bookshelf ID: NBK548309.

[2] European Pharmacopoeia 7.0. Ursodeoxycholic acid, monograph 04/2010:1275.

[3] USP 35–NF 30. Ursodiol (official monograph).

[4] Tonin F, Arends IWCE. Latest development in the synthesis of ursodeoxycholic acid (UDCA): a critical review. Beilstein J Org Chem, 2018, 14: 470–483. doi:10.3762/bjoc.14.33

[5] Development of HPLC-CAD method for simultaneous quantification of nine related substances in ursodeoxycholic acid and identification of two unknown impurities by HPLC-Q-TOF-MS. J Pharm Biomed Anal, 2023. PMID: 36966621; PMCID: PMC10033147

[6] Ding JS, Wang AN, Huang L, Jia W, Liu CX, Lan K. 人体熊去氧胆酸代谢及其生物等效性研究的技术挑战. 药学学报, 2020, 55(9): 2070–2079. doi:10.16438/j.0513-4870.2020-0447

[7] Liu SJ, Yan F, He RR. 内源性药物生物等效性研究技术考虑及案例分析. 药物评价研究, 2025, 48(3): 787–792. doi:10.7501/j.issn.1674-6376.2025.03.025

[8] EMA. Ursodeoxycholic acid capsule, film-coated tablet and suspension product-specific bioequivalence guidance. EMA/CHMP/559890/2021, effective 1 January 2023.

[9] U.S. FDA. Draft Guidance on Ursodiol (Tablet; revised Oct 2024) and Draft Guidance on Ursodiol (Capsule; revised May 2026).

[10] 国家药品监督管理局药品审评中心. 熊去氧胆酸胶囊生物等效性研究技术指导原则, 2021年9月.

[11] Pinto MC, Berton DC, de Oliveira AC, Lazaro CM, Carandina SAC. Method development and validation of ursodiol and its major metabolites in human plasma by HPLC-tandem mass spectrometry. Clin Pharmacol, 2019, 11: 1–13. doi:10.2147/CPAA.S187519