甲氨蝶呤（Methotrexate）的EP全套杂质有哪些？

本次整理基于欧洲药典EP 11.0版本甲氨蝶呤专论，共收录12个可检出杂质，其中**指定杂质（Specified impurities）**共6个，分别为B、C、E、F、H、I；**其他可检出杂质（Other detectable impurities）**共6个，分别为A、D、G、J、K、L。有关物质采用反相HPLC梯度洗脱紫外检测，对映异构体纯度采用手性HPLC单独检测。

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杂质A

• 官方名称：Methotrexate EP Impurity A
• 化学名：(2,4-diaminopteridin-6-yl)methanol
• CAS：73978-41-3
• SMILES：NC1=NC(N)=C2N=C(CO)C=NC2=N1
• EP官方CRS：无
• CATO货号：C1598277

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杂质B

• 官方名称：Methotrexate EP Impurity B
• 化学名：(2S)-2-[[4-[[(2,4-diaminopteridin-6-yl)methyl]amino]-benzoyl]amino]pentanedioic acid
• CAS：1217459-90-9
• SMILES：[H]C@@(NC(=O)C1=CC=C(NCC2=CN=C3N=C(N)N=C(N)C3=N2)C=C1)C(=O)O
• EP官方CRS：无
• CATO货号：C1129291

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杂质C

• 官方名称：Methotrexate EP Impurity C
• 化学名：(2S)-2-[[4-[[(2-amino-4-oxo-1,4-dihydropteridin-6-yl)- methyl]methylamino]benzoyl]amino]pentanedioic acid
• CAS：—
• SMILES：[H]C@@(NC(=O)C1=CC=C(N(C)CC2=CN=C3NC(N)=NC(=O)C3=N2)C=C1)C(=O)O
• EP官方CRS：有
• CATO货号：—

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杂质D

• 官方名称：Methotrexate EP Impurity D
• 化学名：4-[[(2-amino-4-oxo-1,4-dihydropteridin-6-yl)methyl]- methylamino]benzoic acid
• CAS：—
• SMILES：[H]C@@(NC(=O)C1=CC=C(N(C)CC2=CN=C3NC(N)=NC(=O)C3=N2)C=C1)C(=O)O
• EP官方CRS：有
• CATO货号：—

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杂质E

• 官方名称：Methotrexate EP Impurity E
• 化学名：4-[[(2,4-diaminopteridin-6-yl)methyl]methylamino]- benzoic acid
• CAS：1217459-90-9
• SMILES：[H]C@@(NC(=O)C1=CC=C(NCC2=CN=C3N=C(N)N=C(N)C3=N2)C=C1)C(=O)O
• EP官方CRS：有
• CATO货号：C1129291

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杂质F

• 官方名称：Methotrexate EP Impurity F
• 化学名：(2R)-2-[[4-[[(2,4-diaminopteridin-6-yl)methyl]methyl-amino]benzoyl]amino]pentanedioic acid ((R)-methotrexate)
• CAS：51865-79-3
• SMILES：[H]C@(NC(=O)C1=CC=C(N(C)CC2=CN=C3N=C(N)N=C(N)C3=N2)C=C1)C(=O)O
• EP官方CRS：无
• CATO货号：C4X-11546

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杂质G

• 官方名称：Methotrexate EP Impurity G
• 化学名：(2S)-2-[[4-[[4-[[(2,4-diaminopteridin-6-yl)methyl]-methylamino]benzoyl]methylamino]benzoyl]amino]- pentanedioic acid
• CAS：2519848-42-9
• SMILES：[H]C@@(NC(=O)C1=CC=C(N(C)C(=O)C2=CC=C(N(C)CC3=CN=C4N=C(N)N=C(N)C4=N3)C=C2)C=C1)C(=O)O
• EP官方CRS：无
• CATO货号：C4X-11547

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杂质H

• 官方名称：Methotrexate EP Impurity H
• 化学名：(2S)-2-[[4-[[(2,4-diaminopteridin-6-yl)methyl]methyl-amino]benzoyl]amino]-5-methoxy-5-oxopentanoic acid
• CAS：1217459-90-9
• SMILES：[H]C@@(NC(=O)C1=CC=C(NCC2=CN=C3N=C(N)N=C(N)C3=N2)C=C1)C(=O)O
• EP官方CRS：无
• CATO货号：C1129291

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杂质I

• 官方名称：Methotrexate EP Impurity I
• 化学名：(4S)-4-[[4-[[(2,4-diaminopteridin-6-yl)methyl]methyl- amino]benzoyl]amino]-5-methoxy-5-oxopentanoic acid
• CAS：66147-29-3（free base）
• SMILES：[H]C@@(NC(=O)C1=CC=C(N(C)CC2=CN=C3N=C(N)N=C(N)C3=N2)C=C1)C(=O)OC
• EP官方CRS：无
• CATO货号：C4X-115480

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杂质J

• 官方名称：Methotrexate EP Impurity J
• 化学名：dimethyl (2S)-2-[[4-[[(2,4-diaminopteridin-6-yl)methyl]-methylamino]benzoyl]amino]pentanedioate
• CAS：34378-65-9
• SMILES：[H]C@@(NC(=O)C1=CC=C(N(C)CC2=CN=C3N=C(N)N=C(N)C3=N2)C=C1)C(=O)OC
• EP官方CRS：无
• CATO货号：C4X-115410

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杂质K

• 官方名称：Methotrexate EP Impurity K
• 化学名：(2S)-2-[(4-aminobenzoyl)amino]pentanedioic acid
• CAS：4271-30-1
• SMILES：[H]C@@(NC(=O)C1=CC=C(N)C=C1)C(=O)O
• EP官方CRS：无
• CATO货号：C4X-115411

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杂质L

• 官方名称：Methotrexate EP Impurity L
• 化学名：(2S)-2-[[4-(methylamino)benzoyl]amino]pentanedioicacid
• CAS：23044-66-8
• SMILES：[H]C@@(NC(=O)C1=CC=C(NC)C=C1)C(=O)O
• EP官方CRS：无
• CATO货号：C1793548

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数据来源： 欧洲药典（EP 11.0）Methotrexate专论原文 Disregard limit： 0.03 per cent Total impurities limit： sum of impurities other than B, C and E not more than 0.5 per cent

甲氨蝶呤的相关杂质多为与主峰结构高度相似的工艺副产物，分离难度较大。杂质B（氨基蝶呤）与杂质C（N-甲基叶酸）仅存在母环取代基的微小差异，相对保留时间仅相差0.1，EP方法要求两者分离度不低于2.0，对色谱柱的端基封尾质量和流动相pH控制精度要求较高。杂质D（N10-甲基蝶呤酸）与主峰甲氨蝶呤的相对保留时间差仅为0.1，EP要求分离度不低于1.5，若达不到要求需调整流速改善分离，说明该体系对流速的稳定性要求较高。手性杂质F为R-甲氨蝶呤，EP未采用常用的多糖类手性柱，选择了牛白蛋白键合硅胶手性固定相，对流动相的离子强度、pH和有机相比例要求严格，微小变化即可影响对映体的保留因子和分离度（推断）。

从NMPA注册申报的审评视角来看，甲氨蝶呤杂质研究有两个核心关注点：一是手性杂质F（R-甲氨蝶呤）的控制，甲氨蝶呤为单一对映体药物，NMPA要求必须将工艺引入或消旋产生的对映异构体杂质订入质量标准，提供完整的方法学验证数据，EP专论中单独建立了手性色谱方法控制该杂质，限度为3.0%，国内申报可直接参考该方法，仅需根据自身工艺验证杂质的检出限和定量限即可；EMA对该杂质的控制要求与EP一致，无额外加严要求。二是特定杂质的识别与定限，EP明确列出了6个指定杂质，其中杂质C、D、E均有官方CRS，申报时需采用官方CRS进行定位和校正，符合ICH Q3A对原料药杂质鉴定的要求，对于其他可检出的非特定杂质，EP控制限度为0.05%，完全满足NMPA对未知杂质的限度要求，无需额外开展结构确证（推断）。

已经有EP官方CRS的杂质C、D、E，可直接通过EDQM官方渠道获取，是方法学验证和杂质定位的首选对照品。其余杂质EP未提供官方CRS，需要企业自行解决对照品来源，对照品的纯度和溯源性直接影响方法学验证结果的合规性。对于EP列出的其他可检出杂质，按照规则无需强制鉴定，但若在实际生产产品中检出超过0.05%限度的未知杂质，需要按照ICH Q3A要求开展结构确证和安全性评估。如需获取甲氨蝶呤EP全套杂质对照品，包括EP未提供官方CRS的杂质，欢迎联系CATO Research Chemicals（佳途科技）获取支持。

CATO Research Chemicals（佳途科技）提供甲氨蝶呤EP全套杂质对照品，所有产品均通过ISO 17034双认证（CNAS + ANAB），每批次产品附带完整的COA和可溯源证书，完全支持EMA、NMPA以及ICH框架下的各类注册申报场景，能够满足仿制药申报、一致性评价等不同场景的杂质研究需求。